杂志名称：Cellular and Molecular Life Sciences

文献题目：Lecompte, Sophie, et al. "Skeletal muscle secretome in Duchenne muscular dystrophy: a pivotal anti-inflammatory role of adiponectin." Cellular and Molecular Life Sciences 74.13 (2017): 2487-2501.

第一作者：S. Lecompte

作者单位：

Endocrinology, Diabetes and Nutrition Unit, Institute of Experimental and Clinical Research, Catholic University of Louvain

本实验所用产品：RayBio人 AAH-CYT-1000抗体芯片（120个细胞因子抗体芯片）

实验样品：细胞培养上清

研究背景：

杜氏肌营养不良是一种X染色体隐性遗传疾病，主要发生于男孩。据统计，全球平均每3500个新生男婴中就有一人罹患此病。患者在学龄前就会因骨骼肌不断退化出现肌肉无力或萎缩，导致不便行走。大概在7岁到12岁时，会彻底丧失行走能力，通常到20多岁就会因为心肌、肺肌无力而死亡。针对该病，医学界尚无有效疗法。杜氏肌营养不良，一种危害人们的健康的疾病。肌营养不良蛋白缺陷型肌纤维的收缩会产生严重的损伤，并产生肌纤维坏死和再生的循环。这些改变导致慢性炎症，这是这种疾病的发病机制的关键特征。在这种情况下，细胞因子和趋化因子在DMD相关的肌肉炎症中发挥重要和多样化的作用。前期研究表明脂联素（ApN）在骨骼肌上表现出抗炎性质，并减轻mdx小鼠的营养不良表型。在这里，我们研究ApN是否在DMD患者获得的肌管细胞中保留其抗炎作用。我们通过研究其分泌物和ApN的早期关系来揭开潜在的机制。

1 分组

细胞培养上清样本：

DMD组成肌细胞上清（n=4）

对照组成肌细胞上清（n=3）

2 结果

2.1  DMD组及对照组肌小管细胞鉴定

成肌细胞分化为肌管在对照（C）和DMD细胞之间没有差异，如分化开始后第0,3和11天（即分化前后，中期和晚期阶段）。更具体地说，在第11天，成熟肌管在两组中表现出相同的特征性。同样，在分化过程中，在C和DMD细胞中，肌原性标记的基因表达也相似地增加。

2.2 DMD组及对照组自身的脂联素表达

我们检测了基础状态下ApN的生产。与对照组相比，营养不良肌管的ApN mRNA和蛋白表达分别下降约60％〜15％。 这暗示了DMD肌管中ApN的潜在缺陷，并支持推荐肌营养不良中ApN补充的理论。

2.3 脂联素在人类对照和DMD肌管中的抗炎特性

随后对ApN治疗是否在营养不良肌肉中保持其抗炎特性进行研究。为了模拟DMD的炎症微环境，通过炎症因子（TNFα/IFNγ）对肌管进行了刺激，TNFα在恶化疾病中起着关键的致病作用。在C肌管中，TNFα与INFγ结合诱导其自身的基因表达，IL-6的表达被认为是抵抗炎症状态的表现。伴随的ApN治疗，TNFα基因表达的下调（〜-30％），进一步上调IL-6（〜+ 75％）的表达。ApN实际上下调了TNFα mRNA（〜-25％），同时进一步上调IL-6mRNA（〜+ 20％）。 这些数据表明ApN可能在营养不良的肌肉中保留其抗炎特性。

2.4 抗体芯片筛选ApN作用下细胞上清中的差异因子

筛选来自DMD肌管的培养基在或不存在ApN处理的情况下炎症刺激所引起的变化。在测试的120个细胞因子中，64个由肌管分泌。在ApN存在的情况下，10种蛋白分泌有差异：8种细胞因子低分泌，而另外两种则分泌过量。这些肌肉蛋白属于五个家族：促炎因子和抗炎因子/细胞因子，生长因子，可溶性受体和趋化因子。接下来用ELISA定量这些差异因子进行验证。结果表明，通过ApN处理下调两种促炎因子（TNFα和IL-17A），一种可溶性受体（sTNFRII）和一种趋化因子（CCL28）的分泌。相反，只有IL-6上调，其可能具有抗炎特性。

2.5  ApN在对照组和DMD肌管中的抗炎作用的机制

接下来研究连接AdipoR1-SIRT1-PGC-1α的信号通路是否参与了DMD肌管中ApN的抗炎作用。为此，使用特异性siRNA敲除了该途径的每个组分。首先证实，siRNA沉默是有效的，如靶基因表达的显着降低（-65至-95％）。接下来，证明在C肌管中，ApN在存在的条件下发挥其抗炎作用：它降低TNFα（〜55％）和CCL28（-28％） 同时增加IL-6 mRNA（+ 40％）。

当用针对AdipoR1，SIRT1或PGC-1α的siRNA转染肌管时，这些变化被消除。因此，AdipoR1-SIRT1-PGC-1α信号通路的每个组分似乎是ApN在C和营养不良肌肉中的抗炎作用所必需的。

结论：

首先，与对照组相比，营养不良肌管的基础ApN表达和分泌降低。之前的研究已经表明，在急性或慢性炎症的环境中，ApN在体内被“正常”的小鼠骨骼肌过度产生，以局部抵消过度和有害的炎症反应。相比之下，mdx小鼠的骨骼肌不能局部过度产生ApN。同样，这种情况似乎在人类营养不良肌管中也有同样的表现，与对照相比，ApN表达降低。这表明在DMD肌管中ApN的潜在缺陷，并支持在该病理学中推荐ApN补充的说法。 ApN对肌细胞分泌状况的影响仍然很大程度上是不明确的。为了研究ApN治疗前后DMD肌管的分泌物谱。使用Rybiotech的细胞因子抗体芯片进行检测并用ELISA方法进行验证，我们确定了几种由人类营养不良肌管分泌的肌动蛋白是由ApN调节。这些肌肉蛋白属于四个家族：抗炎因子/细胞因子，可溶性受体和趋化因子。ApN下调了几种促炎症分子（TNFα，IL-17A和CCL28），同时上调IL6，其在免疫应答中起双重作用。据我们所知，这两种分子（sTNFRII，CCL28）是人肌管的新型分泌产物。ApN通过AdipoR1和AMPK-SIRT1-PGC-1α途径介导其对控制肌管的保护，从而导致转录因子NF-κB表达下调。总之，ApN通过激活AdipoR1和AMPKSIRT1-PGC-1α途径在营养不良的肌肉中保持其有益的性质，从而诱导下游肌肉分泌向较少炎症分布的转变，同时上调utrophin A、及其下游肌肉ApN，这机制可能成为治疗DMD的关键点，Raybiotech的抗体芯片在该机制的研究中起重要作用。