Abstract

为患者重建特异性的支架来修复独特形状的骨缺损仍然是近年来组织工程的主要临床挑战，当前3D打印支架这种快速生成定制形状的前景技术备受关注。然而，通常用于3D打印的合成聚合物，如聚己内酯(PCL)，缺乏模拟天然细胞外基质功能（支持细胞生长和分化）的生物学能力。本研究研发了一种骨组织工程的富含细胞外基质(ECM)的水凝胶嵌入PCL支架，以人骨髓间充质干细胞来源的基质体(BMTS)作为富集ECM的生物大分子来源，利用人骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)进行体外支架。研究中发现该3D混合模型显示出良好的BM-MSC活性和体外2D和3D培养的成骨活性。通过大鼠颅骨缺损重建模型评估发现，构建的3D混合模型有效地促进了血管化骨再生。因此，基于BMTS的3D混合模型有望成为一种良好的骨组织工程支架，用于骨科应用。

一、研究背景

骨是由嵌入大量胶原束的羟基磷灰石组成的，结合了刚性无机和柔性有机组件，是一种特别的的机械和生物功能的组合，因此，骨重建非常困难，在损伤或组织丢失时骨可能无法保持自然状态，当损伤区域超过临界值时，将难以愈合，这是则需要组织工程的支架来支持新生长和诱导组织再生。

3D结构和多功能组件的集成使得工程化组件的制备成为可能。然而，传统的三维支架大多由非功能性生物材料组成，形成的系统将无法契合生物体环境。因此，骨组织工程复合支架应由硬结构和软结构组成，并结合复杂的生物聚合物来平衡。

聚己内酯(Polycaprolactone, PCL)多孔支架作为一种固体基板，提供了包含软支架组件的固体结构框架，由于PCL具有良好的力学性能和模拟复杂解剖结构的能力，已被广泛应用并利用3D打印技术制备。但相对较差的生物相容性和疏水性，和高温制作过程使得PCL难以搭载生长因子及活细胞。

水凝胶因其优良的生物相容性和对干细胞]的高负载效率可以弥补PCL的缺陷，填充了由胶原蛋白和纤维蛋白原组成的天然聚合物基水凝胶3D-PCL支架的细胞亲和力上升，同时在基质中加入一种血液凝固过程中从纤维蛋白原中提取的纤维蛋白可使基质快速凝固提高机械强度协助组织修复。

BMTS是从人骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)来源的天然ECM中获得的，含有300多种蛋白和相关细胞因子，相对只含胶原和纤维蛋白原的成分的水凝胶来说，BMTS更适合用于直接供应到受损的骨组织中。

二、结果

2.1 PCL、PCL/CF和PCL/CF/BMTS的特征分析

将CF（collagen/fibrin纤维蛋白）水凝胶和BMTS填充的3D打印PCL支架通过特殊工艺结合形成复合支架。测试结果说明MTS整合到PCL/CF支架中并没有引起任何物理性能的差异，内部的孔隙相互连接良好水和营养物运输无碍，BMTS的分子尺寸较小，不影响PCL结构的孔径大小。

2.1.2高通量抗体芯片筛选最适合用于骨再生的BMTS

用RayBio 2000个蛋白高通量抗体芯片( AAH-BLG-2000)分析从各个组织中提取出的BMTS中的生物活性因子种类及含量，对比挑选出最适合用于骨再生的BMTS，可以发现从骨骼、脂肪和皮肤等多种组织中提取出的蛋白质种类及含量范围都相当，但是BM-MSCs中的胶原水平相对较高。

纤维胶原蛋白家族参与组织刚度或强度维持，直接影响机械强度，并且上调参与细胞黏附早期阶段的基因，对ECM信号更敏感，可以为为细胞的增殖和分化提供了良好的环境。

2.2 比较不同培养维度下PCL、PCL/CF和PCL/CF/BMTS支架的细胞活力及成骨基因表达能力

为了确定三种3D支架的生物相容性，研究者按照2D（细胞移植在表面）和3D（细胞封装）的方式对细胞进行孵育。

在两种结构中，各组BM-MSCs均表现出良好的黏附和增殖能力，而PCL/CF/BMTS组的增殖尤为显著。

3D结构中BMTS掺入组表现出BM - MSC特异性成纤维细胞样形态，显著提高细胞黏附的程度，其中的胶原和糖蛋白在细胞黏合及与ECM结合中也起着关键作用。

qRT-PCR分析了骨标志物如胶原蛋白1 (COL1)，骨钙素(OCN)，骨桥蛋白(OPN)，骨涎蛋白(BSP)和骨形态发生蛋白2 (BMP2)的表达发现表达水平较高，其表达水平具有时间依赖性，这些结果表明BMTS的主要成分触发了BM-MSC与CF基质的黏附，并为增殖和成骨分化提供了充分的条件。

2.3 PCL/CF/BMTS支架植入大鼠颅骨缺损模型后新骨组织形成的体内表征

将PCL/CF/BMTS支架植入含有颅骨缺损的大鼠中评估骨重建效果，表明与PCL组相比，PCL/CF/BMTS组的再生显著改善(图6D)。

讨论

本研究研发并测评了一种由3D打印的PCL填充BMTS和CF水凝胶组成复合支架，在研发初期，团队利用了RayBio 人类高通量抗体芯片（AAH-BLG-2000）在骨骼、脂肪和皮肤等多种组织提取的BMTS中挑选了含有利于骨骼修复细胞因子的骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)来源的BMTS，使得该支架在保证机械支撑及物理应力的情况下还可以再生所需的骨组织靶向生物大分子，增强了缺损部位的细胞行为和骨愈合。该材料在小鼠颅骨模型的体内修复实验中也可增强骨素传导和组织修复，在组织工程应用中有广阔前景。