杂志名称:  JEM(The Journal of experimental medicine)  （IF  12.515）

文献引用：

Yang H, Wang H, Ju Z, et al.MD-2 is required for disulfide HMGB1–dependent TLR4 signaling[J]. The Journalof experimental medicine, 2015, 212(1): 5-14.

本实验所用产品：RayBiotech  AAH-CYT-1(23个人细胞因子抗体芯片)

                            AAM-CYT-1(22个小鼠细胞因子抗体芯片)

实验样品：细胞上清

 研究背景:

     机体受到病原体感染或者受到损伤时，宿主先天免疫细胞可以通过模式识别受体激活炎症反应，有效识别病原相关分子模式PAMPs和损伤相关分子模式DAMPs，来检测和清除入侵病原体。例如机体对细菌内毒素LPS的反应是由LBP, CD14, MD-2, TLR4来调控的，LPS被LBP捕获后，传递给CD14、MD-2，然后传递给TLR4，LPS结合TLR4后，激活炎症反应，释放IL1、TNF、IFN、HMGB1等炎症相关因子。HMGB1是一个核蛋白，胞外的HMGB1可以作为感染和损伤引起的炎症疾病的调控者。HMGB1是氧化还原敏感性蛋白，只有部分还原的HMGB1蛋白具有激活免疫细胞分泌细胞因子的特性，而完全还原和完全氧化状态的HMGB1蛋白没有这个特性。但是HMGB1被分泌出来时是不同亚型混合物，免疫系统是如何利用TLR4–MD-2系统去分辨寻找特定亚型的HMGB1？MD-2的拮抗剂筛查和应用，本论文进行了深入研究。

研究思路

1 芯片样品准备

细胞培养和处理

1)      巯基乙酸诱导小鼠腹膜巨噬细胞

2)      原代人巨噬细胞

3)     收集细胞上清检测

2 结果

2.1 disulfide HMGB1能够有效结合MD-2

 如下图所示，在HMGB1的多个亚型中，只有disulfide HMGB1能够诱导细胞表达TNF，并且和MD-2高效结合，当加入anti-HMGB1抗体时，可以有效阻断这种相互作用。

2.2 HMGB1调控的炎症反应依赖MD-2的参与

将RAW264.7细胞沉默MD-2基因， HMGB1刺激野生型细胞和基因沉默细胞，发现TNF、NF-kb、P50、P65的表达在基因沉默细胞中都显著下调。

RayBiotech抗体芯片检测HMGB1刺激细胞上清，发现G-CSF, IL-12p40, IL-6, TNF,RANTES, MCP-1, sTNFR1 这7个细胞因子在基因沉默细胞上清中显著下调。未加HMGB1刺激的细胞组作为对照，发现WT和MD-2KO细胞上清表达无明显差异。同时可以看出，HMGB1可以刺激WT细胞的多个炎症因子高表达。

2.3 寻找MD-2结合的多肽，作为HMGB1的特异结合抑制剂

      SPR和分子对接试验都验证FSSE(P5779)可以有效结合MD-2。

 2.4 RayBiotech抗体芯片验证多肽抑制剂的效果

如下图所示，HMGB1刺激小鼠巨噬细胞可以促进IL6、IL12、RANTES、MCP-1高表达，而P5779可以有效抑制这些因子高表达。

LPS刺激人原代巨噬细胞的多个炎症因子高表达，而P5779不会抑制这些因子的高表达。这说明P5779选择性的抑制HMGB1-MD-2-TLR4信号通路，而不会抑制巨噬细胞对PAMPs的响应。

3 结论

     MD-2能够特异识别HMGB1二硫化物，从而促进TLR4信号传递。FSSE（P5779）作为MD-2的拮抗剂，可以有效抑制HMGB1-MD-2-TLR4信号通路，而不会影响巨噬细胞对PAMPs的响应。该研究揭示了先天免疫系统可以特异识别HMGB1亚型的分子机制，且发现可以针对性衰减损伤相关分子模式DAMPs介导的炎症反应，同时保持抗菌免疫应答。RayBiotech芯片的筛查结果为寻找关键的新的机制提供重要依据。